CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE CURSO DE GRADUAÇÃO BACHARELADO EM BIOMEDICINA PATRICIA MARINHO PINTO MARTINS ESTUDOS IN SILICO DOS MECANISMOS ENVOLVIDOS NO METABOLISMO ENERGÉTICO DO MÚSCULO DE VOO DO MOSQUITO AEDES AEGYPTI Rio de Janeiro 2024 CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE CURSO DE GRADUAÇÃO BACHARELADO EM BIOMEDICINA PATRICIA MARINHO PINTO MARTINS ESTUDOS IN SILICO DOS MECANISMOS ENVOLVIDOS NO METABOLISMO ENERGÉTICO DO MÚSCULO DE VOO DO MOSQUITO AEDES AEGYPTI Projeto de Trabalho de Conclusão de Curso (TCC) apresentado ao Centro Universitário IBMR como parte das exigências para obtenção do título de bacharel em Biomedicina Orientador: Dr. Marcus Fernandes de Oliveira Rio de Janeiro 2024 LISTA DE FIGURAS Figura 1 - Comparação da estrutura dos sarcômeros do músculo de voo de vertebrados e invertebrados............................................................................10 Figura 2 - Representação do músculo de voo direto síncrono e músculo de voo indireto assíncrono em invertebrados..............................................................11 Figura 3 - Representação da estrutura do músculo de voo em insetos..........12 Figura 4 - Esquema representativo do ciclo da contração muscular...............13 Figura 5 – Fluxograma representativo de todas as etapas de identificação e determinação do nível de expressão dos genes envolvidos no metabolismo de ATP...................................................................................................................15 Figura 6 – Gráfico de comparação entre os níveis de expressão de expressão das proteínas envolvidas no metabolismo de ATP…………….........................27 Figura 7 – Localização das principais proteínas expressas e seus genes envolvidos no metabolismo de ATP no músculo de voo no tórax de Aedes aegypti fêmea, obtidas pelo Uniprot..................................................................28 LISTA DE TABELAS Tabela 1 – Informações dos genes de proteínas da F1 ATP sintase em Aedes aegypti, os dados foram obtidos através do Vector Base, Uniprot e BlastP. .............................................................................................................18 Tabela 2 – Informações dos genes de proteínas da Miosina e suas subunidades em Aedes aegypti, os dados foram obtidos através do Vector Base, Uniprot e BlastP……………………………........................................................................19 Tabela 3 – Informações dos genes de proteínas da Sósio/Potássio ATPase e suas subunidades em Aedes aegypti, os dados foram obtidos através do Vector Base, Uniprot e BlastP……………………………..............................................20 Tabela 4 – Informações dos genes da proteína da membrana plasmática cálcio ATPase em Aedes aegypti, os dados foram obtidos através do Vector Base, Uniprot e BlastP………………………………………………...............................21 Tabela 5 – Informações dos genes de das proteínas das subunidades do retículo sarcoplasmático/endoplasmático Ca²+ ATPase em Aedes aegypti, os dados foram obtidos através do Vector Base, Uniprot e BlastP……….......................21 Tabela 6 – Informações dos genes de proteínas das subunidades da arginina quinase em Aedes aegypti, os dados foram obtidos através do Vector Base, Uniprot e BlastP…………………………………………………………….............22 Tabela 7 – Informações dos genes de proteínas das subunidades da translocador de nucleotídeo adenosina (ANT) em Aedes aegypti, os dados foram obtidos através do Vector Base, Uniprot e BlastP...........................................22 Tabela 8 – informações do gene da proteína adenilato quinase em Aedes aegypti, os dados foram obtidos através do Vector Base, Uniprot e BlastP...............................................................................................................23 Tabela 9 – Informações dos genes de proteínas das subunidades da proteína Carreadora de fosfato mitocondrial (PiC) em Aedes aegypti, os dados foram obtidos através do Vector Base, Uniprot e BlastP…………………………………………………………………………………………….23 Tabela 10 – Dados de expressão das proteínas das subunidades das F1 ATP sintase, miosina, sódio potássio ATPase, PMCA, SERCA, arginina quinase, adenilato quinase, ANT e PiC no tórax, corpo todo e relação entre tórax com corpo todo de Aedes aegypti fêmea coletados pelo Aegypti Atlas.................................................................................................................24 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS A. aegypti Aedes aegypti ATP Adenosina trifosfato ADP Adenosina difosfato Pi Fosfato ANT Translocador de ADP/ATP PIC Carreador de fosfato mitocondrial SERCA Ca²+ ATPase retículo sarcoplasmático / endoplasmático PMCA Ca²+ ATPase da membrana plasmática Na+/K+ ATPase Sódio e Potássio ATPase íons de Ca²+ Íons de Cálcio Íons de Na+/K+ Íons de sódio e potássio Mass/ Da Dalton, unidade de peso molecular de proteínas OXPHOS Fosforilação oxidativa DFM Músculo de voo direto (Direct Flight Muscle) IFM Músculo de voo indireto (Indirect Flight Muscle) SUMÁRIO INTRODUÇÃO ……………………….…………………...…………………9 OBJETIVO …………………………………….…........…………………….15 MÉTODOS...............................…………………………………..........…...15 RESULTADOS...............................……………………………………......18 DISCUSSÃO...............................………………………………………......29 CONCLUSÃO.........................................................................................32 AGRADECIMENTOS.............................................................................33 REFERÊNCIAS...............................……………………………………….34 ESTUDOS IN SILICO DOS MECANISMOS ENVOLVIDOS NO METABOLISMO ENERGÉTICO DO MÚSCULO DE VOO DO MOSQUITO AEDES AEGYPTI Patricia Marinho Pinto Martins RESUMO Originário das florestas da África Subsaariana, o mosquito Aedes aegypti, é um transmissor de doenças como dengue, zika, chikungunya e febre amarela. Este inseto se espalhou para diversas partes do globo, predominando em áreas urbanas e domésticas propícias para seu ciclo de vida. Uma característica peculiar deste mosquito é que apenas as fêmeas se alimentam de sangue para desenvolver seus ovos, um processo conhecido como ovogênese. Curiosamente, mesmo após se alimentarem de sangue e triplicarem seu peso, elas conseguem voar. O voo desses mosquitos é impulsionado pelos músculos de voo que se encontram ligados à cutícula do tórax. A atividade do voo requer grande quantidade de energia, proveniente de adenosina trifosfato (ATP) produzido nas mitocôndrias, através da fosforilação oxidativa (OXPHOS). A energia necessária para as células musculares realizarem o processo de contração é transduzida principalmente pelas ATPases, que utilizam a energia resultante da hidrólise do ATP. Este projeto teve por objetivo, estudar os principais mecanismos moleculares envolvidos no metabolismo de ATP no mosquito Aedes aegypti através de análises in sílico. Neste sentido, pretendemos identificar os principais genes envolvidos na síntese e hidrólise de ATP bem como determinar o nível de expressão destes componentes no tórax deste inseto através de abordagem de bioinformática, buscando os genes ortólogos em humanos. Os genes - alvo investigados foram aqueles envolvidos em três processos distintos, i) na hidrólise de ATP pelas ATPases: incluindo miosina, sódio e potássio ATPase, Ca²+ ATPase de membrana plasmática (PMCA), Ca²+ ATPase retículo sarcoplasmático / endoplasmático (SERCA); ii) na síntese de ATP pela OXPHOS: F1 ATP sintase, translocador de ADP/ATP (ANT), carreador de fosfato mitocondrial (PiC); iii) e na transferência de fosfato: arginina quinase e adenilato quinase. Encontramos genes ortólogos de todos os mecanismos envolvidos no metabolismo de ATP em Aedes aegypti, com elevados graus de similaridade com sequências humanas. Deste conjunto de genes, aqueles que são mais expressos no tórax de A. aegypti fêmea são os envolvidos no metabolismo da fosforilação oxidativa se destacando a F1 ATP sintase (subunidades alpha, beta e delta), as subunidades do ANT, o PiC, e os envolvidos na hidrólise de ATP e metabolismo do cálcio como as miosinas (as subunidades de miosina de cadeia leve e miosina de cadeia pesada) e o Ca²+ ATPase retículo sarcoplasmático / endoplasmático, bem como o envolvido na transferência de fosfato a arginina quinase que apresentaram-se mais expressos no tórax. Em síntese, os resultados deste estudo evidenciam que há uma alta relação entre os genes das proteínas estudadas e o metabolismo energético do músculo de voo de Aedes aegypti. Diante do exposto, esperamos que nossas descobertas contribuam como dados para futuros estudos sobre bioenergética e fisiologia destes mosquitos, e que ajudem em estratégias de controle da capacidade de dispersão desses insetos. PALAVRAS-CHAVE: Aedes aegypti, ATPase, músculo de voo, mitocôndria, metabolismo ATP 9 INTRODUÇÃO O Aedes aegypti é um inseto da família Culicidae, sendo considerado um importante vetor de inúmeras arboviroses, incluindo dengue, Zika vírus, chikungunya e febre amarela. (SOARES et al., 2019; ALONSO et al., 2019). A dengue, apresenta uma incidência global estimada de aproximadamente 390 milhões de infecções por ano, representando um sério problema de saúde pública (NAVARRO PAYÁ et al., 2020). Foi no ano de 1818 que este inseto recebeu o nome científico de Aedes aegypti (BRAGA; MEDEIROS, 2018). A sua origem é relatada como um mosquito da área florestal de áreas da África Subsaariana. Contudo, algumas espécies de populações de mosquito na África Ocidental, evoluíram e se expandiram durante a urbanização adaptando-se ao ambiente urbano e doméstico, que possuem aspectos favoráveis para seu ciclo de vida. (ROSE et al., 2023; MUNDIM-POMBO et al., 2021). O A. aegypti é um inseto holometábolo, ou seja, possui um ciclo de vida de 7 a 10 dias com estágios, e se inicia em ovos, quatro estágios de larvas, pupa e terminam adultos, que geralmente vivem de 4 a 6 semanas (MUNDIM-POMBO et al., 2021). A transmissão da doença ordinariamente ocorre de forma horizontal, quando o mosquito se alimenta de sangue de indivíduos infectados. Após oito a doze dias o vírus se instala e se concentra nas glândulas salivares do inseto, de forma que quando ocorre a próxima alimentação sanguínea o mosquito, ao injetar a saliva é capaz de transmitir arboviroses em humanos. O Aedes aegypti macho não se alimenta de sangue, dessa forma as fêmeas são as principais vetores de arboviroses (DE CARVALHO et al., 2021; NAVARRO- PAYÁ et al., 2020; RUNTUWENE et al., 2020; HILL; TAPARIA; IGNELL, 2021; SIM; JUPATANAKUL; DIMOPOULOS, 2014) . A fêmea de Aedes aegypti adulta é hematófaga facultativa, se alimenta de seiva de plantas e necessita da alimentação sanguínea como fonte nutricional essencial para o processo de ovogênese. Mesmo após se alimentarem de sangue e triplicarem seu peso, as fêmeas conseguem manter sua capacidade 10 de voo, sendo esta atividade necessária para dispersão desse inseto (GAVIRAGHI et al., 2019). Estudos indicam que os músculos de voo de insetos e animais vertebrados compartilham características como a estrutura do sarcômero, miofibrilas e proteínas reguladoras da atividade muscular (CAO; JIN, 2020). Outrossim, durante o voo do inseto, a força mecânica é gerada pela ação dos músculos de voo (NAVARRO-PAYÁ et al., 2020). Figura 1: Comparação da estrutura dos sarcômeros do músculo de voo de (A) vertebrados e (B) invertebrados. Ambos possuem similares estruturas do sarcômero com filamentos grossos de miosina sobrepostos e finos filamentos de actina com proteínas estruturais homólogas, porém divergentes. O sarcômero do músculo de voo indireto de invertebrados é mais longo, e as bandas I são mais estreitas em comparação com as do músculo de voo de vertebrados ( Actin – Actina; Myosin – Miosina; Projectin – Projeção; Z disc – Disco Z; M line – Linha M; I band – Banda I; A band – Banda A) (Fonte: CAO; JIN, 2020). Anatomicamente, os músculos de voo estão localizados no tórax desses insetos, e estão divididos em músculos de voo direto síncronos (DFM síncrono) e músculo de voo indireto assíncrono (IFM assíncrono). O músculo de 11 voo direto síncrono está ligado diretamente nas asas e realiza batimentos em baixa frequência. No entanto, o músculo de voo indiretos assíncronos é composto de dois músculos, o músculo longitudinal dorsal (DLM) e músculo dorso ventral (DVM), que desempenham contrações em alta frequência gerando uma modificação na estrutura do tórax resultando no movimento das asas (MESQUITA et al., 2021; CAO; JIN, 2020). O metabolismo do controle de contração e relaxamento no DFM síncrono e IFM assíncrono dependem de impulsos nervosos que controlam os níveis de íons de Cálcio (íons de Ca²+) no citosol da célula muscular. O DFM síncrono contrai e relaxa a cada chegada de impulso nervoso, havendo grande oscilação dos níveis de íons de Ca²+ intracelular. Entretanto, o IFM assíncrono detêm de um mecanismo diferencial no controle dos níveis de íons de Ca²+ intracelular com alta concentração e sem grandes flutuações, sendo mantido com baixa frequência de impulsos nervosos, durante o tempo em que ocorre altas frequências de contração e relaxamento deste músculo.(JOSEPHSON; MALAMUD., 2001; CAO; JIN, 2020 ;IWAMOTO, 2011). A frequência de contração do músculo de voo em insetos requer muita de energia para atividade de voo deste inseto (CELESTINO-MONTES et al., 2021; SOARES; GAVIRAGHI; OLIVEIRA, 2015). Figura 2: Representação do músculo de voo direto e indireto. Na esquerda o movimento das asas pelo músculo de voo direto síncrono, ilustrado pelo inseto libélula, usam o 12 músculo de voo direto para bater as asas durante o voo. A contração do músculo levantador puxa as asas para cima, e o músculo depressor puxa as asas para baixo. Na direita o movimento das asas é retratado na mosca da fruta, que são conduzidos por músculos de voo indiretos assíncronos. O músculo dorsal vertical (DVM) que puxa o tórax e produz um movimento ascendente das asas, enquanto há o alongamento dos músculos longitudinais dorsais (DLM). Subsequente a contração do DLM causa encurtamento anterior e posterior do tórax, resultando em um movimento descendente das asas e alongamento do DVM induzindo o próximo ciclo de contração e relaxamento (Fonte: CAO; JIN, 2020). As mitocôndrias têm um papel fundamental na manutenção do equilíbrio energético celular, contribuindo de maneira significativa para a geração de adenosina trifosfato (ATP) (SOARES, GAVIRAGHI, OLIVEIRA, 2015). Essas organelas são subdivididas em compartimentos altamente especializados, que incluem o espaço da matriz, o espaço intermembranas, a membrana interna e a membrana externa. A membrana interna possui numerosas cristas que aumentam sua superfície total, ela é o local principal onde ocorre a fosforilação oxidativa (OXPHOS). Além disso, é nessa membrana que ocorre a produção de ATP, mediada pela enzima ATP-sintase (BABBAR, SHEIKH, 2013). A energia vital para o voo é obtida a partir da produção de ATP através da OXPHOS nas mitocôndrias (GAVIRAGHI; OLIVEIRA, 2019). Ademais, as mitocôndrias existentes no músculo de voo dos insetos asseguram a suplementação dessa demanda energética (MESQUITA et al., 2021). Figura 3: Ilustração do músculo de voo de insetos e o controle de contração e relaxamento. Retrata a estrutura de um sarcômero único e a unidade mínima da função muscular em: (A) filamento fino, (C) filamento C, (M) filamento grosso, (MT) mitocôndria, (PM) membrana plasmática, (SR) retículo sarcoplasmático, (Tm) tropomiosina, (Tn) troponina, (Z) linha Z (Fonte: IWAMOTO, 2011). 13 A necessidade energética das células é predominantemente determinada pela atividade das ATPases, enzimas que aproveitam da energia resultante da hidrólise de ATP em ADP + Pi (adenosina difosfato + fosfato) para executar trabalho biológico. O controle osmótico, a homeostase dos íons de Ca²+e a contração muscular são alguns dos processos que são conduzidos pela atividade das ATPases (BRUCE ALBERT et al. 2010). A composição do músculo de voo inclui miofibrilas, que são fundamentais para a contração muscular. Além disso, o músculo possui uma organela chamada retículo sarcoplasmático, que é rica em íons de Ca²+. Quando os impulsos nervosos geram um potencial de ação na membrana plasmática e alcançam o retículo sarcoplasmático, este libera Ca²+ no citosol, iniciando a contração das miofibrilas (MESQUITA et al. 2021; GEEVES 2016; BRUCE ALBERT et al. 2010). O Ca²+ liberado se liga à troponina, alterando a conformação da tropomiosina, que está associada aos filamentos de actina. Isso possibilita a interação entre a actina e a cabeça da miosina, resultando na contração muscular, como ilustrado nas figuras 3 e 4 (BRUCE ALBERT et al. 2010). Figura 4 – Esquema representativo do ciclo de contração muscular: Primeiramente, (1) a hidrólise do ATP ocorre, no entanto, o ADP e o fosfato continuam ligados à cabeça da miosina. 14 Em seguida, (2) o cálcio, ao ligar à troponina, desbloqueia o local de interação da actina com a cabeça da miosina, que estava previamente bloqueada pela tropomiosina. No terceiro passo, (3) a miosina se liga à actina, causando um movimento e, ao retornar à sua posição anterior, perde o ADP. No quarto passo, (4) uma molécula de ATP se liga à cabeça da miosina. Finalmente, (5) a ligação do ATP diminui a afinidade da cabeça da miosina pela actina, fazendo com que elas se separem e dando início a um novo ciclo (Fonte: autoral,2024). No entanto, esse processo consome ATP, a principal fonte de energia celular. A miosina ATPase facilita o deslizamento entre a actina e a miosina, enquanto a bomba de Ca²+ ATPase devolve o Ca²+ ao retículo sarcoplasmático, ambos processos através da hidrólise de ATP (GEEVES ,2016; BRUCE ALBERT et al.,2010). Contudo, os principais processos de demanda de energia na contração das fibras musculares do músculo são sustentados pelo transporte de íons de Ca²+ e por hidrólise do ATP no complexo actina e miosina (MESQUITA et al., 2021). Embora alguns estudos acerca dos mecanismos envolvidos no metabolismo de ATP sejam relativamente conhecidos em insetos voadores, pouco se sabe sobre a identidade e o nível de expressão destes no mosquito Aedes aegypti. Postulamos que o mosquito A. aegypti possua genes ortólogos envolvidos no metabolismo de ATP e que a expressão daqueles envolvidos na OXPHOS e na contração muscular seja predominante no músculo de voo. A atividade da ATPase nos músculos de voo de Aedes aegypti fêmea está diretamente relacionada à regulação do metabolismo energético durante o voo. Supomos que os níveis de atividade da ATPase estão correlacionados com a demanda energética associada ao voo, com uma maior atividade observada durante os períodos de voo prolongado. Além disso, acreditamos que as adaptações metabólicas específicas nos músculos de voo, como a regulação da OXPHOS e hidrólise de ATP, serão evidenciadas pela análise da expressão e atividade de enzimas-alvo envolvidas nessas vias metabólicas. Nossa hipótese sugere que a regulação das ATPase e do metabolismo energético nos músculos de voo é essencial para o desempenho do voo e a sobrevivência desses mosquitos. Dessa maneira, nossa hipótese permite a exploração da relação entre a atividade da ATPase e o metabolismo energético durante o voo das fêmeas de A. aegypti, com implicações importantes para entender a fisiologia e 15 metabolismo desse mosquito e desenvolver estratégias de controle mais eficazes. OBJETIVO Estudar os principais mecanismos moleculares envolvidos no metabolismo de ATP no mosquito Aedes aegypti através de análise in sílico. Metas: a) Identificar os principais genes envolvidos na síntese e hidrólise de ATP; b) Determinar o nível de expressão destes componentes no tórax deste inseto através de uma abordagem bioinformática. METODOLOGIA 1) Fluxograma de análise de bioinformática Figura 5- Fluxograma representativo de todas as etapas de identificação e determinação do nível de expressão dos genes envolvidos no metabolismo de ATP humanos e Aedes aegypti. 16 a) Busca da ATPase de humano e busca da sequência FASTA no Uniprot: Um dos bancos de dados usados foi o Uniprot (https://www.uniprot.org/) que é um repositório de informações de proteínas e diversos organismos, possui uma base de dados de sequências previamente revisadas e informações funcionais das proteínas, sendo o banco de dados mais utilizado pela comunidade científica (THE UNIPROT CONSORTIUM et al., 2023;BOWLER- BARNETT et al., 2023). Os dados foram obtidos no Uniprot os dados da identidade da proteína (Entry), quantidade de aminoácidos, peso molecular (Mass/ Da), e também a sequência FASTA de aminoácidos dos genes identificados de humanos. b) Busca e identificação da sequência FASTA dos genes- alvo de Aedes aegypti: Foi utilizado o “basic local alignment basic tool” para proteínas, o Blastp (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE=Proteins) que é uma plataforma de acesso livre e mantido pelo Instituto Nacional da Saúde e Centro Nacional de Biotecnologia e Informações (NIH/NCBI), que permite identificar genes ortólogos semelhantes ao gene de interesse (CHENG et al., 2022). Na ferramenta Blastp primeiro foi pesquisado por genes de Aedes aegypti buscando pelo código AAEL. Primeiro foi obtido a sequência de aminoácidos de uma das ATPases de humanos do Uniprot e posteriormente no Blastp foi colocado primeiro o sinal de maior (>), depois a identidade da proteína e embaixo adicionado a sequência de aminoácidos, e na parte de escolha da pesquisa no item organismo foi adicionado a busca para “Aedes aegypti”. Nos resultados foi observado o código AAEL e obtido as informações de Query Cover, E value, Percentual de identidade. Este processo foi repetido para todas as proteínas pesquisadas separadamente. 17 c) Identificação dos genes-alvo de Aedes aegypti ortólogos humanos Para informações das proteínas codificadas pelo genoma de Aedes aegypti utilizamos o site do Vectorbase (https://vectorbase.org), uma base de dados que contém informações detalhadas dos produtos gênicos codificados pelos genomas de organismos vetores de doenças (GIRALDO-CALDERÓN et al., 2015). Contudo depois de ter achado o AAEL no BlastP, foi copiado o endereço de acesso e buscado no Vector Base pelo AAEL. Após a busca foi copiado a sequência FASTA de aminoácidos no Vectorbase para cada proteína separadamente. Subsequentemente foi obtido a sequência fasta do Vectorbase e no Blastp colocado primeiro o sinal de maior (>), depois a identidade da proteína e embaixo adicionado a sequência FASTA de aminoácidos, e na parte de escolha da pesquisa no item organismo foi adicionado a busca para “homo sapiens”. Nos resultados foi observado e obtido as informações de Query Cover, E value, Percentual de identidade. Este processo foi repetido para todos os genes pesquisados separadamente. d) Critérios de dados do Blastp O Blastp possui parâmetros de resultados como o E-value que retrata o número de ocorrências que podem ser encontradas por acaso, sendo quanto o menor o seu valor maior são as chances de o resultado não ser por acaso. Outro parâmetro do Blastp é a porcentagem de identidade (Percentage Identify) que constitui o valor do número de aminoácidos que correspondem exatamente na mesma posição a sequência da consulta. Possui ainda a cobertura da consulta (Query Cover), que expressa em porcentagem a quantidade de sequências enviadas que conseguiram fazer o alinhamento. Neste projeto foi utilizado como critério os valores de Query Cover ≥ 50%, E value ≥ 1e -20, Percentage Identify ≥ 30% para os resultados das ATPases. (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE=Proteins). 18 e) Determinação dos níveis de expressão dos genes alvo em tórax e corpo todo de Aedes aegypti fêmea. Utilizamos ainda o portal Aegypti-Atlas que é um site que possui os dados referentes aos níveis de expressão dos genes em diferentes tecidos e partes do corpo de fêmea de Aedes aegypti (HIXSON et al., 2022). Após as proteínas estarem de acordo com a classificação dos critérios selecionados pelo Blastp, foi pesquisado com o código do AAEL, a expressão delas no tórax e corpo inteiro de fêmeas utilizando informações fornecidas pelo Aegypti-Atlas (http://aegyptiatlas.buchonlab.com). 2. Levantamento Bibliográfico: Para o levantamento bibliográfico foi realizada uma busca utilizando os descritores em inglês foram: mitochondria, Aedes aegypti, ATPase, Myosin, F1 ATP Synthase, Flight muscle, PMCA, SERCA. Para a seleção das produções científicas foram utilizados os seguintes critérios de inclusão: livros e artigos publicados no período de 2000 até 2024, disponíveis na íntegra e online nas bases de dados Pubmed. RESULTADOS Tabela 1 – A tabela abaixo apresenta informações dos genes de proteínas da F1 ATP sintase em Aedes aegypti, os dados foram obtidos através do Vector Base, Uniprot e Blastp. Na tabela 1, são apresentados os genes codificados de subunidades da F1 ATP sintase encontradas no Aedes aegypti. A F1 ATP sintase alpha está associada ao AAEL012175, a F1 ATP sintase beta ao AAEL003393, a F1 ATP 19 sintase gamma ao AAEL008848 e a F1 ATP sintase delta ao AAEL002504, juntamente com seus respectivos códigos no Uniprot. Ao analisar os resultados dos ortólogos humanos dessas proteínas, observamos que todos os critérios das quatro subunidades da F1 ATP sintase encontradas estão dentro dos valores estabelecidos. A subunidade alpha e beta apresentam um maior "Query cover” de 99% e 97%, respectivamente, e um percentual de identidade de 83% e 88%, respectivamente. Podemos confirmar que essas subunidades são homólogas às encontradas em humanos. Identificamos ainda a subunidade epsilon da F1 ATP sintase, no entanto, devido ao valor do E value ser 3 e-07, foi excluída da tabela de resultados finais por estar abaixo do critério de valor esperado. Tabela 2 – A tabela abaixo apresenta informações dos genes de proteínas da Miosina e suas subunidades em Aedes aegypti, os dados foram obtidos através do Vector Base, Uniprot e Blastp. A Tabela 2 lista todas as miosinas identificadas como ortólogos humanos, juntamente com seus genes AAEL correspondentes do Vector Base e seus respectivos endereços Uniprot. A quantidade de aminoácidos de cada proteína foi obtida pelo Vector Base, e os valores de 'Query cover', 'E value' e percentual de identidade foram encontrados através do blastp, utilizando a sequência fasta 20 de cada miosina na busca por ortólogos humanos. Os resultados foram significativos, com todas as miosinas cumprindo os critérios estabelecidos. Destaca-se a existência de três isoformas de miosina sete: miosina VII A 1 (AAEL001220), miosina VII A (AAEL008610) e miosina 7 (AAEL021838). Todas apresentaram alto 'Query cover', 'E value' zero e percentual de identidade acima de 50%, indicando uma correlação positiva com serem homólogas humanas. Similarmente, a miosina de cadeia pesada (AAEL026217) é ortóloga da miosina 2 humana, desempenhando um papel crucial na contração muscular, e conforme os dados observados na Tabela 2, o valor de cobertura da consulta foi de 96%, indicando que seu alinhamento foi quase total e que suas funções são provavelmente muito similares. Por fim, a miosina 1C (AAEL01195) e a miosina VIIA1 (AAEL008610) apresentaram os melhores valores de Blastp, com 99% de cobertura e percentuais de identidade acima de 50%. Isso demonstra uma significativa semelhança na sequência de aminoácidos com os ortólogos humanos. Tabela 3 - A tabela abaixo apresenta informações dos genes de proteínas da Sódio/Potássio ATPase e suas subunidades em Aedes aegypti, os dados foram obtidos através do Vector Base, Uniprot e Blastp. A subunidade alfa de sódio potássio ATP ase com AAEL012062, exposta na tabela 3, apresenta um resultado de cobertura da consulta de 99%, um valor de E value de 0 e uma identidade de 77%, sugerindo sua semelhança com a dos humanos. Por outro lado, não foi observado um valor de identidade igual ou superior a 30 na Sódio Potássio ATP ase beta -1 com AAEL010148 e na Sódio Potássio ATP ase beta com AAEL010145, como estabelecido como critério. No 21 entanto, como essas proteínas apresentaram valores de cobertura da consulta e E value dentro dos padrões estabelecidos, elas foram mantidas nos resultados. Tabela 4 - A tabela abaixo apresenta informações do gene da proteína da membrana plasmática cálcio ATPase em Aedes aegypti, os dados foram obtidos através do Vector Base, Uniprot e Blastp. A Tabela 4 apresenta os resultados de uma proteína transportadora de cálcio, a ATPase da membrana plasmática, identificada pelo código AAEL 019458. Esta proteína exibe uma alta similaridade com ortólogo humano, conforme evidenciado pelos valores positivos obtidos na análise Blastp. Esses valores estão bem alinhados com os critérios estabelecidos, reforçando a semelhança percebida. Tabela 5 – A tabela abaixo apresenta informações dos genes de proteínas das subunidades do Ca²+ ATPase retículo sarcoplasmático/endoplasmático em Aedes aegypti, os dados foram obtidos através do Vector Base, Uniprot e Blastp. Na pesquisa por ortólogos humanos no Blastp, foram identificadas duas Ca²+ ATPases do retículo sarcoplasmático, as quais estão detalhadas na Tabela 5. Conforme esses dados, a SERCA com identificação AAEL006582 demonstra melhores resultados nos parâmetros estabelecidos como critério, comparada à SERCA com identificação AAEL003518. Isso pode sugerir uma possível homologia com ortólogo humano da SERCA do AAEL006582. 22 Tabela 6 – A tabela abaixo apresenta informações dos genes de proteínas das subunidades da arginina quinase em Aedes aegypti, os dados foram obtidos através do Vector Base, Uniprot e Blastp. Na Tabela 6, é possível observar os resultados de duas proteínas arginina quinase: AAEL006042 e AAEL009185. A primeira arginina quinase apresenta um valor de cobertura, E value e percentual de identidade menor do que a segunda arginina quinase citada. Portanto, com base nesses dados, pode-se sugerir que a arginina quinase AAEL009185 possui maior similaridade com a creatina quinase humana. Tabela 7 – A tabela abaixo apresenta informações dos genes de proteínas das subunidades da translocador de nucleotídeo adenosina (ANT) em Aedes aegypti, os dados foram obtidos através do Vector Base, Uniprot e Blastp. O translocador ADP/ATP foi encontrado em duas isoformas de proteínas de um único ortólogo humano. Segundo a tabela 7, as duas ANT: AAEL00485 e AAEL010884 apresentaram similaridades bastante elevadas no Blastp. Os valores de cobertura da consulta foram de 96% e 97%. Além disso, o alinhamento com a sequência humana foi quase 100%. 23 Tabela 8 - A tabela abaixo apresenta informações do gene da proteína adenilato quinase em Aedes aegypti, os dados foram obtidos através do Vector Base, Uniprot e Blastp. A Tabela 8 apresenta dados referentes à adenilato quinase mitocondrial, identificada pelo código AAEL012731. Os valores dos parâmetros analisados no programa Blastp estão em conformidade com os critérios estabelecidos, o que sugere que estas podem ser proteínas homólogas às humanas. No processo inicial de busca por proteínas ortólogas, analisou-se outra adenilato quinase, com o código AAEL009334. Entretanto, essa proteína expressou um valor de E value inferior ao estabelecido como critério, portanto, foi excluída do resultado final. Tabela 9 - A tabela abaixo apresenta informações dos genes de proteínas das subunidades da proteína carreadora de fosfato mitocondrial (PiC) em Aedes aegypti, os dados foram obtidos através do Vector Base, Uniprot e Blastp. As duas subunidades de proteínas carreadoras de fosfato mitocondrial estão apresentadas na Tabela 9, e seus respectivos genes são: AAEL011184 e AAEL019717, a semelhança de query cover e percentual de identidade das duas proteínas é notável estando em consonância com parâmetros estabelecidos e a possibilidade de sugestão de serem duas proteínas ortólogas de humano. 24 Tabela 10 – A tabela abaixo contém dados do valor de expressão em transcritos por milhão (TPM) das proteínas das subunidades das F1 ATP sintase, miosina, sódio potássio ATPase, PMCA, SERCA, arginina quinase, adenilato quinase, ANT e PiC no tórax, corpo todo e relação entre tórax com corpo todo de Aedes aegypti fêmea coletados pelo Aegypti Atlas. 25 Constata-se na tabela 10 dados dos valores em transcrito por milhão das expressões no tórax, corpo todo e a relação tórax e corpo todo de A. aegypti fêmea, evidenciando a especificidade tecidual de cada proteína estudada. Podemos observar com esses resultados que há alta expressão das quatro subunidades de F1 ATP sintase no tórax de Aedes aegypti fêmea, sendo as mais expressas no tórax em relação com o corpo todo a F1 ATP sintase alpha AAEL012175, a F1 ATP sintase beta AAEL003393 e a F1 ATP sintase gamma AAEL008848. Esses resultados corroboram assim com o princípio que a F1 ATP sintase em Aedes aegypti fêmea é primordial para síntese de ATP no músculo de voo localizado no tórax. Já a F1 ATP sintase delta possui uma considerável expressão no tórax, apesar da sua baixa relação tórax e corpo todo, podendo demonstrar sua baixa especificidade no tórax. A tabela ilustra detalhes a respeito da expressão das proteínas de 13 subunidades de miosina, conforme revelado pelo Aegypti Atlas. Notavelmente, as subunidades miosina de cadeia pesada AAEL026217 e a de cadeia leve AAEL12207 são as mais expressivas no tórax, em comparação com as outras subunidades de miosina. Contudo, conforme demonstrado na tabela 2, a miosina de cadeia leve apresenta dados de cobertura e percentual de identidade do Blastp um tanto inferiores à miosina de cadeia pesada. Segundo as descobertas do Aegypti Atlas, essas duas miosinas são, provavelmente, as principais encarregadas pela contração muscular no músculo de voo no tórax. No entanto, a miosina AAEL000596 e a miosina VIIA AAEL008610 não exibiram expressão no tórax, resultando em uma relação entre tórax e corpo todo igual a zero. Dados apresentados na tabela 10 sobre as subunidades de proteínas do sódio e potássio ATPase, demonstram que todas as subunidades possuem maior expressão no tórax do que no corpo todo de Aedes aegypti fêmeas. A sódio e potássio ATPase subunidade alpha 3 AAEL012062 manifestou-se mais expressa no tórax, e a Sódio Potássio ATPase beta 1.1 AAEL010783 apresenta a relação entre tórax e corpo todo relativamente maior que todas as outras proteínas. Salientando com isso o controle do gradiente de sódio e potássio 26 dentro e fora das células musculares tornando-as eletricamente excitáveis a estímulos de contração. Na tabela encontram-se informações da proteína da Ca²+ ATPase membrana plasmática (PMCA) em relação a sua expressão no tórax e corpo todo de Aedes aegypti fêmea, porém sua expressão é relativamente parecida no tórax e no corpo. Entretanto, observamos a subunidade da proteína Ca²+ ATPase retículo sarcoplasmático / endoplasmático AAEL006582 apresenta-se muito expressa no tórax, sendo uma proteína potencial na participa da contração muscular nesses insetos controlando a liberação de cálcio para ativação do complexo actina e miosina. Examinamos os dados na tabela 10 referentes a duas subunidades da arginina quinase no Aedes Aegypti fêmea, especificamente sua expressão tanto no tórax quanto no corpo inteiro. Notamos que a subunidade AAEL009185 da arginina quinase apresenta uma expressão predominante no tórax em comparação ao corpo inteiro, especialmente quando contrastada com a outra subunidade da mesma proteína. Ademais observamos na tabela, as expressões de duas subunidades do ANT no Aedes aegypti fêmea, e podemos identificar que o translocador de ADP/ATP AAEL010884 é consideravelmente muito expresso no tórax. Verossimilmente realizando um papel fundamental na troca de ADP e ATP para o controle de energia na contração muscular. A tabela 10 apresenta dados da expressão da proteína adenilato quinase AAEL012731 do Aedes aegypti fêmea, todavia esta proteína se expressa mais no corpo do que no tórax, caracterizando pouca relevância no mecanismo de contração do músculo de voo no tórax. As informações da expressão da proteína carreadora de fosfato mitocondrial no tórax e corpo todo de Aedes aegypti estão descritas na tabela 10, na qual pode ser observado que a proteína com AAEL011184 é mais expressa no tórax que o AAEL19717 que é relativamente mais expresso no corpo todo. Desse modo de consonância com a função da proteína carreadora de fosfato que transportam o fosfato junto com próton para matriz das mitocôndrias 27 para ser utilizado na produção de ATP, pode dizer que a alta expressão da proteína carreadora de fosfato mitocondrial do gene AAEL011184 e alta especificidade tecidual conforme dados na tabela 10, pode estar relacionada com sua atividade no tórax desse mosquito. Figura 6 – Gráfico de comparação entre os níveis de expressão por Transcritos por Milhão em Log2 das proteínas envolvidas no metabolismo de ATP ( F1 ATP sintase, miosina, sódio/potássio ATPase, Ca²+ ATPase membrana plasmática, Ca²+ ATPase retículo sarcoplasmático/endoplasmático, adenilato quinase, arginina quinase ,translocador ADP/ATP, a proteína carreadora de fosfato mitocondrial (PiC) ) no tórax de Aedes aegypti fêmea, dados coletados no Aegypti Atlas ( Fonte: autoral, 2024). A figura 6 fornece uma visão abrangente da comparação entre os níveis de expressão em transcrito por milhão por Log2, das proteínas envolvidas no metabolismo de ATP no tórax das fêmeas de Aedes aegypti, com os valores retirados da tabela 10. O eixo horizontal ilustra o nível de expressão de cada proteína, enquanto o eixo vertical exibe as proteínas analisadas sendo representadas pelas barras e os pontos representam cada gene das subunidades encontradas e a variável de nível de expressão entre elas. 0 5 10 15 20 F1 ATP sintase Miosina Na/K ATPase PMCA SERCA Adenilato quinase Arginina quinase ANT PiC Thorax Expression (log2) 28 Com base nesses dados, é possível observar que a proteína Translocador ADP/ATP (ANT) do AAEL010884 apresenta a maior expressão, com uma variação significativa entre as subunidades encontradas. Em seguida, vem o Ca²+ ATPase retículo sarcoplasmático / endoplasmático (SERCA) do gene AAEL006582, que também apresenta uma variação expressiva entre suas subunidades. A terceira proteína mais expressa é a F1 ATP Sintase Alpha do AAEL012175, embora a variação entre as expressões das subunidades seja relativamente baixa. A proteína carreadora de fosfato mitocondrial do AAEL011184 ocupa a quarta posição, com uma variação considerável entre suas subunidades. A F1 ATP Sintase Delta do AAEL002504, a Arginina Quinase do AAEL00195, a Sódio/Potássio ATPase do AAEL012062 e as Miosinas do AAEL026217 e do AAEL012207, respectivamente, exibem níveis de expressão consideravelmente altos. Consequentemente, esses resultados fornecem esclarecimentos valiosos sobre quais proteínas apresentam maior atividade no metabolismo de ATP no músculo de voo encontrado no tórax das fêmeas de Aedes aegypti. 29 Figura 7 - Localização das principais proteínas expressas e seus genes envolvidos no metabolismo de ATP no músculo de voo no tórax de Aedes aegypti fêmea, informações obtidas pelo Uniprot (Fonte: autoral, 2024). Conforme ilustrado na figura 7, descrevemos a representação esquemática das proteínas que participam do metabolismo de ATP, e os genes que se mostraram mais expressos encontram-se no miócito e na miofibrila. A F1 ATP sintase, ANT, PiC e a adenilato quinase são localizadas nas mitocôndrias, enquanto a arginina quinase é encontrada no citosol do miócito. Já a PMCA e a Na+/K+ ATPase estão situadas na membrana dos miócitos, a SERCA está localizada no retículo sarcoplasmático e as miosinas nas miofibrilas. Todas as informações de localização foram obtidas através do Uniprot. DISCUSSÃO Os resultados apresentados neste trabalho reforçam a nossa hipótese, que as proteínas que metabolizam ATP são primordiais no mecanismo na produção e utilização de ATP no músculo de voo do Aedes aegypti. É possível supor que as proteínas analisadas por dados de análise de bioinformática revelaram que há uma forte similaridade evolutiva entre os ortólogos estudados. Foi observado também que as principais ATPases que participam da capacidade metabólica de sustentação da energia no tórax de Aedes aegypti fêmea estão bastante expressas como a F1 ATP sintase, ANT, PiC, SERCA, miosinas e a arginina quinase. Podemos destacar que a reduzida permeabilidade interna da mitocôndria é fundamental para a fosforilação oxidativa do ADP pela ATP sintase. No entanto, o movimento dessas moléculas altamente carregadas na membrana mitocondrial é facilitado por uma proteína conhecida como Translocador de ADP/ATP, ou ANT (JEREMY M. BERG et al., 2014). Em nossa pesquisa encontramos resultados da expressão de ANT no tórax das fêmeas, sendo estas as mais expressivas com genes AAEL010884 e AAEL004855. 30 É possível supor a partir dos dados obtidos, uma atividade relevante dessa proteína no músculo de voo, corroborando o estudo conduzido por GAVIRAGHI e colaboradores em 2019. Este estudo examinou em mitocôndrias isoladas de fêmeas de Aedes aegypti a concentração de ADP e a taxa respiratória, demonstrando que o aumento do ADP é proporcional à respiração celular. Portanto podemos dizer que há uma forte correlação que o ANT desempenha um papel crucial no processo de respiração celular e produção de ATP favorecendo a capacidade de energia do músculo de voo desses insetos. Os resultados da F1 ATP sintase indicam que as subunidades mais expressas no tórax são alfa (associada ao gene AAEL012175), beta (associada ao gene AAEL0033993) e delta (associada ao gene AAEL002504), respectivamente. Esta expressão pode ser justificada pela produção primária de ATP na proteína ATP sintase. Esta proteína é composta por duas subunidades distintas: Fo, que está inserida na membrana mitocondrial interna; e F1, que se projeta para a matriz mitocondrial (JEREMY M. BERG et al., 2014).A subunidade F1 aloja conjuntos de compartimentos alfa e beta, que circundam a subunidade gama, e um compartimento delta que se liga à subunidade Fo (KÜHLBRANDT, 2019). As cadeias polipeptídicas alfa e beta apresentam semelhanças, porém, apenas a cadeia beta está diretamente envolvida na catálise, sendo componentes da F1 ATPase. Na cadeia alfa ocorre a produção de ATP, enquanto a subunidade delta promove o movimento de rotação impulsionado pela subunidade Fo (JEREMY M. BERG et al., 2014). Estas observações sugerem que a subunidade F1 desempenha um papel na síntese e hidrólise de ATP no tórax das fêmeas do mosquito Aedes aegypti, influenciando na energia necessária para a contração dos músculos de voo desses insetos. O estudo conduzido por PATRICK et al. (2006) analisou a expressão da Na+/K+ ATPase em órgãos da fêmea de Aedes aegypti de 5 a 7 dias após a eclosão. Para isso, utilizaram RT-PCR de homogenato de tórax e abdome, com análise adicional do túbulo de malpighi separado. Observaram a presença da Na+/K+ ATPase na região basal da membrana do estômago, contudo, o estudo não forneceram dados sobre a presença desta ATPase no tórax. Em 31 contrapartida, em nossa pesquisa, identificamos uma expressão marcante da Na+/K+ ATPase alfa com AAEL012062 no tórax das fêmeas de Aedes aegypti. A sódio e potássio ATPase, também conhecida como bomba de sódio e potássio, realiza hidrólise de ATP para efetuar o transporte de três íons de sódio para fora da célula e dois íons de potássio para dentro, criando assim um gradiente Na+/K+. Este processo é essencial para o controle do volume celular e para aumentar a excitabilidade elétrica das células musculares. Além disso, a pesquisa de Dash; Dib-Hajj; Waxman (2018) em camundongos revelou que a actina e a miosina interagem com a Na+/K+ ATPase alpha, reforçando a importância crucial desta bomba na geração do gradiente elétrico necessário para a estimulação dos miócitos na contração muscular (DASH; DIB-HAJJ; WAXMAN, 2018; JEREMY M. BERG et al., 2014). De acordo com CAO; JIN, (2020) a forma como os músculos de voo do inseto contrai e relaxa é parecida com a dos músculos esqueléticos dos vertebrados, onde a contração é causada pela despolarização da membrana do miócito em resposta aos impulsos dos nervos motores. O ciclo de contração- relaxamento depende do aumento e diminuição do cálcio no citosol. Com base nessas informações, podemos concluir que a alta expressão da proteína SERCA com gene AEEL006582, influencia o ciclo de contração do músculo de voo no tórax de fêmeas de Aedes aegypti. Também é possível identificar uma correlação significativa entre nossa descoberta acerca da expressão de miosinas e os músculos síncronos e assíncronos encontrados em insetos voadores, responsáveis pela frequência do batimento das asas (CAO;JIN, 2020). A miosina de cadeia pesada, codificada pelo gene AAEL026217, e a miosina de cadeia leve, codificada pelo gene AAEL12207, apresentaram uma expressão muito superior às outras miosinas analisadas neste estudo. A miosina de cadeia pesada e a miosina de cadeia leve, em combinação com a actina, constituem as principais miosinas contráteis. (VICENT-MANZANARES et al., 2009; JAMES R. SELLERS, 2000). O controle de ATP muscular é vital em estresse, pois os níveis de ATP podem diminuir rapidamente se não houver ações para suplementar a sua produção ou minimizar seu uso. A arginina quinase é uma enzima importante 32 para controle da fonte de energia dos músculos, destacando-se que ela é mais comum em invertebrados, e tem função similar à creatina quinase encontrada em vertebrados (DAWSON; STOREY, 2011). Conclui-se que a arginina quinase com AAEL009185 sendo a mais expressa em nosso resultado, é relevante para o controle da produção de ATP no músculo de voo de Aedes aegypti fêmea. A proteína carreadora de fosfato mitocondrial que está localizada na membrana interna das mitocôndrias, desempenha um papel importante na produção de ATP através da fosforilação oxidativa, sendo necessário uma molécula de ADP+Pi para síntese de ATP. A proteína ANT transporta ATP para o citosol e ADP para dentro das mitocôndrias, e a proteína PiC restaura os depósitos de fosfato no interior da mitocôndria (GAO; VONCKEN; COLASANTE, 2020). Em suma, a alta expressão da proteína PiC, identificada como AAEL011184, está em conformidade com as evidências que sugerem que esta proteína pode estar envolvida na regulação do metabolismo energético do músculo de voo em fêmeas de Aedes aegypti. No entanto, mais pesquisas devem ser feitas para avaliar as atividades das proteínas encontradas no músculo de voo desses insetos. CONCLUSÃO As proteínas que participam tanto na produção ou hidrólise de ATP e na fosforilação oxidativa, são essenciais na contração e relaxamento do músculo de voo de Aedes aegypti estudado. Com base nessas descobertas significativas, o estudo amplia nosso entendimento sobre a bioenergética do músculo de voo das fêmeas de Aedes aegypti. A identificação de similaridades de proteínas ortólogas entre A. aegypti e humanos adiciona uma camada fascinante à compreensão da fisiologia desse vetor de doenças. Além disso, os resultados dos níveis de expressão gênica das proteínas no tórax das fêmeas destacam áreas promissoras para investigações futuras sobre os mecanismos moleculares subjacentes ao voo e à fisiologia metabólica desses insetos. Essas descobertas não apenas contribuem para os debates atuais sobre a biologia do Aedes aegypti, mas também têm implicações 33 importantes para o controle de doenças transmitidas por mosquitos, oferecendo potencialmente novos alvos para intervenções científicas e estratégias de controle de vetores. AGRADECIMENTOS À Deus primeiramente, pela minha vida, por ter permitido ultrapassar a pandemia do Covid e obstáculos ao longo dos meus anos de estudo. Aos meus pais e meu marido que me ajudaram e muito contribuíram durante o processo de estudos e compreenderam minha ausência durante a realização deste trabalho. Ao meu orientador por ter dedicado tempo e atenção me orientando com total mestria. Aos meus amigos da faculdade e do laboratório pela amizade e pelo apoio demostrado ao longo desse período de tempo dedicado a este trabalho. Aos professores da IBMR pela paciência e dedicação pela qual guiaram meus anos de estudo, mesmo passando pela pandemia do Covid. 34 REFERÊNCIAS AEGYPTI – ATLAS, 2023. Disponível em http://aegyptiatlas.buchonlab.com/ ALONSO, D. P. et al. Gene expression profile of Aedes aegypti females in courtship and mating. Scientific Reports, v. 9, n. 1, p. 15492, 29 out. 2019. BABBAR, M.; SHEIKH, M. S. Metabolic Stress and Disorders Related to Alterations in Mitochondrial Fission or Fusion. Molecular and Cellular Pharmacology, v. 5, n. 3, p. 109–133, 2013. Basic Local Alignment Search Tool, Blast, 2023. Disponível em https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi Bioinformatics Resources for Invertebrate Vectors of Human Pathogenos, VectorBase, 2023. Disponível em https://vectorbase.org/vectorbase/app/ Biological Sciences, University of California, Irvine, CA 92697, USA and 2Department of Biology, Emory University, Atlanta, GA 30322, USA, v. The Journal of Experimental Biology 204, 4125–4139, 2001. 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